Production de protéines recombinantes en cellules CHO

Sciences pharmaceutiques · Master 2

Upstream, downstream, banques cellulaires et contrôle viral dans la production biopharmaceutique.

Introduction

La plupart des anticorps monoclonaux et de nombreuses protéines thérapeutiques complexes sont produits dans des cellules de mammifère, en particulier les cellules ovariennes de hamster chinois (CHO). Ce choix repose sur leur capacité à réaliser des modifications post-traductionnelles proches de celles de l'humain, notamment la glycosylation, sur leur croissance en suspension à haute densité dans des milieux sans sérum, et sur une longue expérience réglementaire.

Le procédé se divise en deux grandes parties. L'amont (upstream) comprend l'expansion des cellules issues de la banque de cellules de travail, puis la culture en bioréacteur, souvent en mode fed-batch, avec contrôle du pH, de la température, de l'oxygène dissous et de l'apport en nutriments. L'aval (downstream) comprend la récolte, la clarification, la purification et la formulation. La purification d'un anticorps passe typiquement par une chromatographie d'affinité sur protéine A, une inactivation virale à pH bas, des étapes de polissage par échange d'ions et une filtration virale.

La qualité du produit dépend de l'ensemble du procédé: la glycosylation, l'agrégation et les impuretés liées au procédé (protéines de la cellule hôte, ADN résiduel) doivent rester dans des limites définies. Le principe de qualité par la conception et la surveillance des attributs critiques de qualité garantissent la cohérence entre lots et la comparabilité après un changement de procédé.

Objectifs d'apprentissage

Expliquer pourquoi les cellules CHO sont des hôtes de choix
Décrire les étapes d'amont et d'aval d'un bioprocédé
Distinguer banque de cellules maître et banque de travail
Décrire la purification d'un anticorps et la sécurité virale
Identifier les attributs critiques de qualité, dont la glycosylation

Concepts clés

Cellules CHO: Lignée de mammifère adaptée à la culture en suspension, capable de glycosyler les protéines de façon compatible avec l'humain et de produire de grandes quantités de protéine sécrétée. Elles sont peu sensibles à de nombreux virus humains.
Banques de cellules: La banque de cellules maître est constituée à partir du clone sélectionné et caractérisée en profondeur; à partir d'elle, on prépare des banques de travail utilisées en production. Ce système assure la stabilité génétique et la traçabilité.
Culture en fed-batch: Les cellules croissent dans un bioréacteur auquel on ajoute des nutriments au cours du temps. PH, oxygène dissous, température et agitation sont contrôlés, et les métabolites comme le lactate et l'ammoniac sont surveillés.
Purification en aval: Après clarification, la protéine A capture spécifiquement la région Fc des IgG. Une inactivation virale à pH bas, des chromatographies d'échange d'ions ou d'interaction hydrophobe, et une filtration virale éliminent impuretés et virus.
Attributs critiques de qualité: Glycosylation, agrégats, charge, pureté et activité biologique sont des attributs dont la variation peut influencer efficacité, sécurité ou immunogénicité. Le procédé est conçu et contrôlé pour les maintenir dans des limites.

Conclusion

Le bioprocédé en cellules CHO illustre la complexité de la production des médicaments biologiques: des cellules vivantes, un milieu contrôlé, puis une chaîne de purification et de sécurité virale. La qualité est déterminée par le procédé lui-même.

Comprendre l'amont, l'aval et les attributs critiques de qualité permet au pharmacien et au biotechnologue d'évaluer la cohérence entre lots, la comparabilité après changement et les exigences des autorités.

Cartes

Que signifie CHO ?: Cellules ovariennes de hamster chinois (Chinese Hamster Ovary).
Pourquoi utiliser des cellules CHO plutôt que des bactéries pour un anticorps ?: Elles assemblent correctement les chaînes, sécrètent la protéine et la glycosylent, ce qu'Escherichia coli ne fait pas.
Qu'est-ce que l'upstream ?: L'ensemble des étapes de culture cellulaire, de l'expansion à la production en bioréacteur.
Qu'est-ce que le downstream ?: Les étapes de récolte, purification et formulation de la protéine produite.
Quelle est la différence entre banque maître et banque de travail ?: La banque maître est la source caractérisée à partir de laquelle on prépare des banques de travail utilisées en production courante.
Qu'est-ce qu'une culture fed-batch ?: Une culture en bioréacteur alimentée en nutriments au fil du temps, sans soutirage continu du milieu.
Quels paramètres contrôle-t-on dans le bioréacteur ?: Le pH, la température, l'oxygène dissous, l'agitation et l'apport en nutriments.
Quelle étape capture spécifiquement un anticorps ?: La chromatographie d'affinité sur protéine A, qui se lie au Fc de l'IgG.
Pourquoi inactiver les virus à pH bas ?: Pour inactiver les virus enveloppés potentiellement présents, comme étape de sécurité virale après l'élution de la protéine A.
Quelles impuretés liées au procédé doit-on éliminer ?: Les protéines de la cellule hôte, l'ADN résiduel, la protéine A relarguée et les agrégats.
Pourquoi la glycosylation est-elle un attribut critique ?: Elle influence la demi-vie, les fonctions effectrices (ADCC, CDC) et l'immunogénicité de l'anticorps.
Que signifie la comparabilité après un changement de procédé ?: La démonstration que le produit avant et après changement reste de qualité, sécurité et efficacité équivalentes.
Pourquoi filtrer sur membrane virale ?: Pour retenir physiquement les virus selon leur taille, étape complémentaire à l'inactivation.

Glossaire

Bioréacteur: Cuve contrôlée dans laquelle des cellules sont cultivées pour produire une substance.
Fed-batch: Mode de culture où les nutriments sont ajoutés au cours du temps sans retirer le milieu jusqu'à la récolte.
Banque de cellules maître: Lot caractérisé de cellules congelées constituant la source de toutes les productions.
Protéine A: Ligand d'affinité se liant au Fc des IgG, utilisé pour capturer les anticorps.
Titre: Concentration de la protéine produite dans le milieu de culture à la récolte.
Protéines de la cellule hôte: Protéines de la cellule productrice qui contaminent le produit et doivent être éliminées.
Attribut critique de qualité: Propriété du produit dont la variation peut affecter la sécurité ou l'efficacité et qui doit rester dans des limites.
Filtration virale: Étape de filtration sur membrane de très petite porosité qui retient les virus.