Spectrophotométrie UV-visible et loi de Beer-Lambert

Sciences pharmaceutiques · Bachelor 2

Absorbance, loi de Beer-Lambert, déviations et dosage pharmaceutique par UV-visible.

Introduction

La spectrophotométrie d'absorption UV-visible mesure la fraction de lumière absorbée par une solution à une longueur d'onde donnée. Elle exploite le fait que de nombreuses molécules pharmaceutiques, portant des chromophores comme des cycles aromatiques ou des systèmes conjugués, absorbent dans l'ultraviolet ou le visible. C'est une méthode simple, rapide et peu coûteuse, très utilisée pour doser des principes actifs, suivre une dissolution ou vérifier une identité.

La grandeur mesurée est la transmittance, rapport entre l'intensité transmise et l'intensité incidente. On lui préfère l'absorbance, logarithme négatif de la transmittance, car elle est proportionnelle à la concentration dans des conditions idéales. La loi de Beer-Lambert exprime cette proportionnalité: A = epsilon x l x c, où epsilon est le coefficient d'absorption molaire, l la longueur du trajet optique et c la concentration.

Cette loi n'est valable que dans un domaine limité: solutions diluées, lumière monochromatique, absence de réaction chimique ou d'association. En pratique, on travaille à la longueur d'onde du maximum d'absorption et on choisit des concentrations donnant des absorbances comprises entre environ 0,2 et 0,8. Une courbe d'étalonnage établie avec des solutions de référence permet alors de calculer la concentration de l'échantillon.

Objectifs d'apprentissage

Définir transmittance et absorbance et les relier
Énoncer et appliquer la loi de Beer-Lambert
Expliquer le choix de la longueur d'onde et du matériau des cuves
Identifier les causes de déviation de la linéarité
Réaliser un dosage par courbe d'étalonnage et en vérifier la validité

Concepts clés

Transmittance et absorbance: La transmittance T vaut I / I0 et l'absorbance A vaut log10(I0 / I), soit -log10(T). Une absorbance de 1 correspond à une transmission de 10 % de la lumière.
Loi de Beer-Lambert: A = epsilon x l x c. À longueur d'onde et trajet optique constants, l'absorbance est proportionnelle à la concentration, ce qui permet de doser. Le coefficient epsilon est caractéristique de la substance à une longueur d'onde donnée.
Choix de la longueur d'onde: On travaille généralement au maximum d'absorption (lambda max), où la sensibilité est la plus grande et où une petite erreur de longueur d'onde influe peu sur l'absorbance mesurée.
Limites de la loi: Aux fortes concentrations, les interactions entre molécules, la lumière parasite, les réactions d'association ou de dissociation et la lumière non monochromatique entraînent des déviations et une perte de linéarité.
Courbe d'étalonnage et blanc: On mesure des étalons de concentrations connues, on trace A en fonction de c, puis on lit la concentration de l'échantillon. Le blanc, contenant le solvant et les réactifs sans analyte, corrige les absorptions parasites.

Conclusion

La spectrophotométrie UV-visible est un outil d'analyse quantitative simple fondé sur la loi de Beer-Lambert. Sa fiabilité dépend du choix de la longueur d'onde, de la qualité du blanc, de la plage d'absorbance et de la construction rigoureuse d'une courbe d'étalonnage.

Connaître ses limites permet d'éviter les erreurs de dosage et de décider quand recourir à une méthode séparative comme la HPLC.

Cartes

Comment définit-on la transmittance T ?: T = I / I0, rapport de l'intensité lumineuse transmise à l'intensité incidente.
Comment relier absorbance et transmittance ?: A = log10(1 / T) = -log10(T).
Quelle est l'expression de la loi de Beer-Lambert ?: A = epsilon x l x c.
Que représente epsilon ?: Le coefficient d'absorption molaire, propre à la substance, au solvant et à la longueur d'onde (en L mol-1 cm-1).
Quelle absorbance correspond à 10 % de transmission ?: A = 1, car -log10(0,1) = 1.
Pourquoi travaille-t-on au lambda max ?: Pour maximiser la sensibilité et réduire l'effet d'une petite erreur de longueur d'onde.
Quelle plage d'absorbance est idéale pour la mesure ?: Environ 0,2 à 0,8, où l'erreur relative est la plus faible et la loi respectée.
Pourquoi utiliser des cuves en quartz dans l'UV ?: Le verre et certains plastiques absorbent en dessous d'environ 320 à 350 nm; le quartz est transparent dans l'UV.
À quoi sert le blanc ?: À mettre à zéro l'appareil et à corriger l'absorption du solvant et des réactifs.
Citez une cause de déviation de la loi de Beer-Lambert.: Concentration trop élevée, lumière non monochromatique, lumière parasite ou équilibre chimique (association, dissociation).
Qu'est-ce qu'un chromophore ?: Groupe d'atomes responsable de l'absorption de la lumière, comme un système conjugué ou un cycle aromatique.
Si A = 0,40 avec epsilon = 8000 L mol-1 cm-1 et l = 1 cm, quelle est la concentration ?: c = A / (epsilon x l) = 0,40 / 8000 = 5,0 x 10-5 mol/L.
Pourquoi dilue-t-on un échantillon trop concentré ?: Pour ramener l'absorbance dans le domaine de linéarité où la loi est valide.

Glossaire

Absorbance: Grandeur sans dimension égale à log10(I0 / I), proportionnelle à la concentration dans le domaine de la loi de Beer-Lambert.
Transmittance: Fraction de la lumière incidente qui traverse l'échantillon.
Coefficient d'absorption molaire: Constante caractérisant la capacité d'une substance à absorber la lumière à une longueur d'onde donnée.
Trajet optique: Épaisseur de solution traversée par la lumière, souvent 1 cm.
Lambda max: Longueur d'onde du maximum d'absorption d'une substance.
Courbe d'étalonnage: Droite reliant l'absorbance à la concentration, construite avec des solutions de référence.
Blanc: Solution sans analyte contenant le solvant et les réactifs, utilisée pour corriger l'absorption de fond.
Chromophore: Groupe fonctionnel d'une molécule responsable de son absorption dans l'UV ou le visible.