HPLC en phase inversée: rétention, efficacité et résolution

Sciences pharmaceutiques · Bachelor 3

Principe de la HPLC, paramètres de séparation et lecture d'un chromatogramme pharmaceutique.

Introduction

La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est la technique de séparation la plus utilisée en analyse pharmaceutique, pour doser une substance active, rechercher des impuretés ou étudier la stabilité d'une forme galénique. Une phase mobile liquide est poussée à haute pression à travers une colonne remplie d'une phase stationnaire; les constituants de l'échantillon y sont retenus de façon différente selon leurs interactions, puis détectés à la sortie.

En phase inversée, la phase stationnaire est apolaire, le plus souvent de la silice greffée par des chaînes octadécyle (C18), et la phase mobile est polaire, un mélange d'eau ou de tampon avec du méthanol ou de l'acétonitrile. Les composés les plus polaires sortent en premier, les plus lipophiles sont davantage retenus. Le pH de la phase mobile joue un rôle déterminant pour les acides et bases faibles car il règle leur degré d'ionisation et donc leur rétention.

Pour juger d'une séparation, on utilise des paramètres chiffrés: temps de rétention, facteur de rétention, nombre de plateaux théoriques, résolution entre deux pics et facteur de symétrie. Ces critères d'aptitude du système, repris par la Pharmacopée européenne, doivent être satisfaits avant toute analyse de routine.

Objectifs d'apprentissage

Décrire les éléments d'une chaîne HPLC et le principe de la phase inversée
Calculer et interpréter le facteur de rétention et la résolution
Comparer l'élution isocratique et l'élution en gradient
Expliquer l'influence du pH et de la composition de la phase mobile
Utiliser les critères d'aptitude du système avant un dosage

Concepts clés

Chaîne HPLC: Elle comprend réservoirs de solvants, pompe, injecteur, colonne thermostatée, détecteur (souvent UV à barrettes de diodes) et système d'acquisition. La pression élevée est nécessaire pour faire passer la phase mobile à travers des particules fines.
Phase inversée: La phase stationnaire apolaire C18 retient les molécules lipophiles par interactions hydrophobes. Augmenter la proportion de solvant organique dans la phase mobile diminue la rétention.
Facteur de rétention: Le facteur k vaut (tR - t0) / t0, où tR est le temps de rétention du composé et t0 le temps mort. Une valeur d'environ 2 à 10 est généralement recherchée pour une séparation convenable.
Efficacité et résolution: Le nombre de plateaux théoriques mesure l'efficacité de la colonne. La résolution entre deux pics dépend de la sélectivité, de l'efficacité et de la rétention; une valeur supérieure ou égale à 1,5 correspond à une séparation à la ligne de base.
Isocratique et gradient: En élution isocratique, la composition de la phase mobile est constante; en gradient, elle évolue, par exemple en augmentant la teneur en organique, ce qui permet de séparer des composés de polarités très différentes en un temps raisonnable.

Conclusion

La HPLC en phase inversée repose sur un équilibre entre rétention, sélectivité et efficacité. La composition et le pH de la phase mobile, le choix de la colonne et le mode d'élution permettent d'obtenir des séparations robustes pour les principes actifs et leurs impuretés.

L'interprétation des paramètres chiffrés et le contrôle d'aptitude du système garantissent la fiabilité des résultats dans un laboratoire de contrôle qualité.

Cartes

Quelle est la phase stationnaire typique en HPLC en phase inversée ?: De la silice greffée par des chaînes alkyle, le plus souvent C18 (octadécyle), apolaire.
Quel type de composé est élué en premier en phase inversée ?: Les composés les plus polaires, peu retenus par la phase apolaire.
Comment diminuer la rétention en phase inversée ?: En augmentant la proportion de solvant organique (acétonitrile ou méthanol) dans la phase mobile.
Comment s'exprime le facteur de rétention k ?: k = (tR - t0) / t0, avec tR le temps de rétention et t0 le temps mort.
Qu'est-ce que le temps mort t0 ?: Le temps que met un composé non retenu pour traverser la colonne.
Quelle résolution est requise pour une séparation à la ligne de base ?: Une résolution d'environ 1,5 ou plus.
Que mesure le nombre de plateaux théoriques ?: L'efficacité de la colonne: plus il est grand, plus les pics sont fins.
Pourquoi le pH de la phase mobile est-il important pour un acide faible ?: Il règle son état d'ionisation: la forme neutre est plus retenue que la forme ionisée en phase inversée.
Quand préférer un gradient à l'élution isocratique ?: Quand l'échantillon contient des composés de polarités très différentes qui ne sortent pas dans un temps raisonnable en isocratique.
Quel détecteur courant fournit un spectre UV de chaque pic ?: Le détecteur à barrettes de diodes, utile pour vérifier la pureté d'un pic.
Comment dose-t-on une substance active par HPLC ?: En comparant l'aire du pic de l'échantillon à celle de solutions étalons, sur une droite d'étalonnage ou par étalon externe.
Que traduit un pic traînant (asymétrique) ?: Souvent des interactions secondaires avec les silanols résiduels ou une colonne dégradée; on contrôle le facteur de symétrie.
Pourquoi réaliser un test d'aptitude du système ?: Pour vérifier avant l'analyse que le système fournit résolution, répétabilité et symétrie conformes aux critères.

Glossaire

Phase stationnaire: Matériau fixe de la colonne avec lequel les solutés interagissent et qui détermine leur rétention.
Phase mobile: Liquide qui entraîne les composés à travers la colonne.
Temps de rétention: Temps écoulé entre l'injection et le maximum du pic d'un composé.
Facteur de rétention: Grandeur sans dimension reflétant le temps passé par un composé en phase stationnaire par rapport à la phase mobile.
Résolution: Mesure de la séparation de deux pics voisins, fondée sur l'écart de rétention rapporté à leurs largeurs.
Plateaux théoriques: Indicateur de l'efficacité d'une colonne, calculé à partir du temps de rétention et de la largeur du pic.
Élution en gradient: Mode dans lequel la composition de la phase mobile varie au cours de l'analyse.
Barrettes de diodes: Détecteur UV mesurant simultanément l'absorbance à de nombreuses longueurs d'onde.