# Production de protéines recombinantes chez E. coli et les levures

Microbiologie & immunologie · Master 2

> Systèmes d'expression, corps d'inclusion, glycosylation et choix de l'hôte.

## Introduction

La production de protéines recombinantes, par exemple d'insuline, d'hormone de croissance ou de vaccins sous-unitaires, est un pilier de la biotechnologie moderne. Le choix de l'hôte (E. coli, Saccharomyces, Pichia pastoris, cellules CHO) dépend de la taille de la protéine, de ses ponts disulfure et de sa glycosylation.

Chez E. coli, le système pET (promoteur T7 induit par IPTG, souche BL21(DE3)) donne de hauts rendements mais les protéines peuvent s'agréger en corps d'inclusion. La levure Pichia pastoris, induite par le méthanol (promoteur AOX1), sécrète des protéines avec des glycosylations de type mannose.

Le procédé doit respecter les BPF. La pureté, l'absence d'endotoxines et la caractérisation sont contrôlées avant l'autorisation de Swissmedic, qui suit les lignes directrices de l'EMA et de l'ICH.

## Objectifs d'apprentissage

- Comparer les hôtes d'expression
- Décrire le système pET/T7
- Expliquer les corps d'inclusion et leur renaturation
- Décrire la purification par étiquette His
- Évaluer les exigences de pureté

## Concepts clés

- **Système pET/T7** : L'ARN polymérase T7 est codée dans BL21(DE3) sous contrôle lacUV5. L'IPTG l'induit, qui transcrit le gène cible sous promoteur T7.
- **Corps d'inclusion** : Agrégats insolubles de protéines mal repliées. Isolés par centrifugation, solubilisés par urée ou guanidine, puis renaturés.
- **Pichia pastoris** : Levure méthylotrophe, croissance à haute densité, sécrétion, promoteur AOX1 induit par le méthanol et réprimé par le glucose.
- **Glycosylation** : E. coli ne glycosyle pas ; la levure ajoute des mannoses riches (hyperglycosylation), ce qui est inadapté pour certaines protéines humaines ; les cellules CHO donnent des profils plus proches.
- **Purification** : Chromatographie d'affinité (étiquette poly-His sur Ni-NTA), échange d'ions, exclusion de taille, élimination des endotoxines (LPS).

## Conclusion

Le choix de l'hôte d'expression est une décision d'ingénierie qui équilibre rendement, repliement, modifications post-traductionnelles, pureté et coût.

## Cartes

### Quel hôte est le plus simple et rapide pour exprimer une petite protéine ?

E. coli.

### Quelle souche est utilisée avec pET ?

BL21(DE3), portant le gène de l'ARN polymérase T7.

### Que fait l'IPTG dans ce système ?

Il induit l'expression de la T7 polymérase via lacUV5.

### Qu'est-ce qu'un corps d'inclusion ?

Agrégat de protéine recombinante mal repliée, dense et insoluble.

### Comment récupérer une protéine des corps d'inclusion ?

Lyse, lavage, solubilisation en urée ou guanidine, puis renaturation par dialyse ou dilution.

### Pourquoi choisir Pichia pastoris ?

Haute densité, sécrétion, glycosylation eucaryote, promoteur AOX1 puissant.

### E. coli peut-il réaliser des glycosylations de type humain ?

Non, il ne possède pas la machinerie de glycosylation eucaryote.

### Quel est le rôle d'une étiquette His6 ?

Permettre la purification par chromatographie d'affinité sur nickel.

### Pourquoi doser les endotoxines ?

Le LPS d'E. coli est pyrogène et dangereux chez l'humain.

## Glossaire

- **Vecteur d'expression** : Plasmide portant promoteur, site de clonage et marqueur de sélection.
- **Promoteur T7** : Promoteur reconnu spécifiquement par l'ARN polymérase T7.
- **Chaperonne** : Protéine qui assiste le repliement d'une autre protéine.
- **Ni-NTA** : Résine chélatant le nickel qui fixe les étiquettes poly-histidine.
- **Endotoxine** : Lipopolysaccharide de la membrane externe des bactéries à Gram négatif.
- **Méthylotrophe** : Organisme capable d'utiliser le méthanol comme source de carbone.
- **Pont disulfure** : Liaison covalente S-S entre cystéines, formée dans un environnement oxydant.

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